TUGAS KIMIA ANALITIK LANJUT
METODE AMPEROMETRI (VOLTAMETRI)
DAN APLIKASINYA (DETEKSI HIBRIDISASI DALAM BIOSENSOR ELEKTROKIMIA)
D
I
S
U
S
U
N
OLEH:
NAMA : MASMEI SIALLAGAN
NIM : 809142028
KELAS : PENDIDIKAN KIMIA-B
PRODI MAGISTER PENDIDIKAN KIMIA
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
MEDAN
2010
DAFTAR ISI
Daftar Isi…………………………………………………………………………………... 1
I. Pendahuluan…………………………………………………………....................... 2
II. Teknik Voltametri ....………………………………………………………………… 4
III. Biosensor dan Aplikasinya……….…...……………………………………………. 5
IV. Penutup………………………………….……………..….………………………… 31
Daftar Pustaka ………………………………………………………………………….. 32
METODE AMPEROMETRI (VOLTAMETRI) DAN APLIKASINYA
(DETEKSI HIBRIDISASI DALAM BIOSENSOR ELEKTROKIMIA)
I. Pendahuluan
Voltametri
Voltametri merupakan elektrolisis dalam ukuran mikroskala dengan menggunakan mikro elektroda kerja, disebut juga teknik arus voltase. Potensial dari mikro elektroda kerja divariasikan dan arus yang dihasilkan dicetak sebagai fungsi dari poetnsial. Hasil cetakan ini disebut voltamograf.
Voltametri mempelajari hubungan voltase arus-waktu selama elektrolisis dilakukan dalam suatu sel, di mana suatu elektroda mempunyai luas permukaan yang relative besar, dan elektroda yang lain (elektroda kerja) mempunyai luas permukaan yang sangat kecil dan seringkali dirujuk sebagai mikroelektroda: lazimnya teknik ini mencakup pengkajian pengaruh perubahan voltase pada arus yang mengalir di dalam sel. Mikroelektroda ini biasanya dibuat dari bahan tak reaktif yang menghantar listrik seperti emas, platinum atau karbon, dan dalam beberapa keadaan dapat digunakan suatu elektroda merkurium tetes (D.M.E); untuk kasus istimewa ini teknik itu dirujuk sebagai polarografi (Bassett, J.,1994).
Voltametri merupakan metoda elektrokimia yang mengamati perubahan arus dan potensial. Potensial divariasikan secara sistematis sehingga zat kimia tersebut, mengalami oksidasi dan reduksi dipermukaan elektroda. Dalam voltametri, salah satu elektroda pada sel elektrolitnya terpolarisasi. Penelahan pada sistem tersebut diikuti dengan kurva arus tegangan. Metode ini umum digunakan untuk menentukan komposisi dan analisis kuantitatif larutan.
Dalam sistem voltametri ada yang disebut dengan siklik voltametri. Voltametri ini merupakan tehnik voltametri dimana arus diukur selama penyapuan potensial dari potensial awal ke potensial akhir dan kembali lagi potensial awal atau disebut juga penyapuan (scanning) dapat dibalik kembali setelah reduksi berlangsung. Dengan demikian arus katodik maupun anodik dapat terukur. Arus katodik adalah arus yang digunakan pada saat penyapuan dari arus yang paling besar menuju arus yang paling kecil dan arus anodik adalah sebaliknya (Khopkar, 1985).
Voltametri merupakan metoda elektrokimia yang mengamati perubahan arus dan potensial. Potensial divariasikan secara sistematis sehingga zat kimia tersebut, mengalami oksidasi dan reduksi dipermukaan elektroda. Dalam voltametri, salah satu elektroda pada sel elektrolitnya terpolarisasi. Penelahan pada sistem tersebut diikuti dengan kurva arus tegangan. Metode ini umum digunakan untuk menentukan komposisi dan analisis kuantitatif larutan.
Dalam sistem voltametri ada yang disebut dengan siklik voltametri. Voltametri ini merupakan tehnik voltametri dimana arus diukur selama penyapuan potensial dari potensial awal ke potensial akhir dan kembali lagi potensial awal atau disebut juga penyapuan (scanning) dapat dibalik kembali setelah reduksi berlangsung. Dengan demikian arus katodik maupun anodik dapat terukur. Arus katodik adalah arus yang digunakan pada saat penyapuan dari arus yang paling besar menuju arus yang paling kecil dan arus anodik adalah sebaliknya (Khopkar, 1985).
Sel voltametri, terdiri dari 3 elektroda yaitu elektroda pembanding, elektroda kerja, dan elektroda pembantu. Elektroda kerja pada voltametri tidak bereaksi, akan tetapi merespon elektroda aktif apa saja yang ada dalam sampel. Pemilihan elektroda bergantung pada besarnya range potensial yang diinginkan untuk menguji sampel (Ewing, 1975).
Voltametri sama halnya dengan potensiometer, yaitu mempunyai elektroda kerja dan elektroda pembanding, bedanya pada voltametri ditambah dengan sebuah elektroda yaitu elektroda pembantu (auxillary electrode) sehingga voltameter mempunyai 3 buah elektroda pada amperometer elektroda pembanding yang mempunyai potensial yang sudah tetap sehingga kelebihan arus ditangkap oleh elektroda pembantu. Salah satu elektrodanya adalah elektroda merkuri/dropping mercury elektroda (DME) yang bertindak sebagai elektroda kerja. Elektroda pasangannya adalah elektroda kalomel jenuh (SCE) yang bertindak sebagai elektroda pembanding. SCE ini dapat juga digantikan oleh reservoir merkuri (Pungor,1995).
Voltametri sama halnya dengan potensiometer, yaitu mempunyai elektroda kerja dan elektroda pembanding, bedanya pada voltametri ditambah dengan sebuah elektroda yaitu elektroda pembantu (auxillary electrode) sehingga voltameter mempunyai 3 buah elektroda pada amperometer elektroda pembanding yang mempunyai potensial yang sudah tetap sehingga kelebihan arus ditangkap oleh elektroda pembantu. Salah satu elektrodanya adalah elektroda merkuri/dropping mercury elektroda (DME) yang bertindak sebagai elektroda kerja. Elektroda pasangannya adalah elektroda kalomel jenuh (SCE) yang bertindak sebagai elektroda pembanding. SCE ini dapat juga digantikan oleh reservoir merkuri (Pungor,1995).
II. Teknik Voltametri
a. Polagrafi
Polarografi adalah suatu bentuk elektrolisis dalam mana elektroda kerja berupa suatu elektroda yang istimewa, sutau elektroda merkuri tetes, dan dalam mana direkam suatu kurva arus voltase (voltammogram). Seperti yang digunakan oleh kebanyakan pengarang, istilah polarografi adalah suatu kasus istimewa daripada voltametri dalam mana mikroelektrodanya adalah merkurium tetes. Karena sifat –sifat istimewa elektroda ini, polarografi jauh lebih meluas penggunaanya dibandingkan voltametri yang menggunakan mikroelektroda lain (Underwood, 1996). Polarogarfi digunakan secara luas untuk analisis ion –ion logam dan anion –anion anorganik, seperti IO dan NO . Gugus fungsi senyawa organik yang mudah teroksidasi atau tereduksi juga dipelajari dalam polarogarfi. Gugus fungsi yang digunakan meliputi karbonil, asam karboksilat, dan senyawa karbon yang memiliki ikatan rangkap (David, 2000).
b. Hydrodynamic Voltametri
Arus pada hydrodynamic voltametri diukur sebagai fungsi dari aplikasi potensial pada elektroda kerja. Profil potensial yang sama digunakan untuk polarografi, seperti sebuah pengamatan linear atau pulsa diferensial, digunakan dalam hydrodynamic voltametri. Hasil voltamogram yang identik untuk polarografi, kecuali untuk kekurangan arus menghasilkan osilasi dari penambahan tetes merkuri. Karena hydrodynamic voltametri tidak dibatasi untuk elektroda Hg, hydrodynamic voltametri bermanfaat untuk analisis reduksi atau oksidasi pada potensial yang lebih positif.
c. Stripping Voltametri
Salah satu dari teknik voltametri kuantitatif yang lebih penting adalah stripping voltametri, yang mana terdiri atas tiga teknik yang terkait : anoda, katoda, dan adsorpsi stripping voltametri. Sejak anodic stripping voltametri ditemukan aplikasi paling luas, kita mempertimbangkannya secara detail. Anodic stripping voltametri terdiri dari dua tahap Pertama pengontrolan potensial elektrolisis yang mana elektroda kerja, biasanya tetes merkuri atau lapis tipis merkuri, pada potensial katoda yang cukup untuk melapisi ion logam pada elektroda. Tahap kedua, potensial anoda di scan kearah potensial yang lebih positif. Ketika potensial pada elektroda kerja cukup positif analit dilepaskan dari elektroda, larutan dikembalikan dalam bentuk oksidasi. Arus selama tahap stripping dimonitor sebagai fungsi dari potensial, memberikan bentuk kenaikan pada puncak voltammogram yang sama. Puncak arus yang proporsional pada konsentrasi analit dalam larutan. Anodic stripping voltametri sangat sensitif pada percobaan, yang mana harus dikontrol dengan hati-hati jika hasilnya ingin akurat dan tepat.
d. Amperometri
Teknik voltametri terakhir yang dipertimbangkan adalah amperometri, yang mana potensial konstan diaplikasikan pada elektroda kerja, dan arus diukur sebagai fungsi waktu Karena potensial tidak discan, amperometri tidak mendorong kearah voltammogram.
Aplikasi yang penting dari amperometri adalah dalam kontruksi sensor kimia. Sensor amperometri yang pertama dikembangkan untuk melarutkan O dalam darah, yang mana dikembangkan pada 1956 oleh L.C. Clark.
Aplikasi yang penting dari amperometri adalah dalam kontruksi sensor kimia. Sensor amperometri yang pertama dikembangkan untuk melarutkan O dalam darah, yang mana dikembangkan pada 1956 oleh L.C. Clark.
III. Biosensor dan Aplikasinya
Di abad milenium ini, segala sesuatu yang serba praktis dan mudah serta ditunjang oleh manfaatnya yang besar, pastilah di cari oleh setiap orang. Salah satunya adalah sensor. Aplikasi sensor yang paling sering kita jumpai adalah pintu otomatis yang terdapat di pusat-pusat perbelanjaan. Pintu akan terbuka dan tertutup secara otomatis apabila ada orang yang lewat. Contoh lainnya adalah detektor logam yang terdapat pada bandara udara, ataupun detektor asap yang terdapat dalam perkantoran.
Secara umum, sensor sebenarnya dibedakan menjadi dua jenis yaitu sensor fisika dan sensor kimia. Sensor fisika lebih kepada kemampuannya untuk mendeteksi kondisi besaran fisika seperti tekanan, gaya, tinggi permukaan air laut, kecepatan angin, dan sebagainya. Sedangkan sensor kimia merupakan alat yang mampu mendeteksi fenomena kimia seperti komposisi gas, kadar keasaman, susunan zat suatu bahan makanan, dan sebagainya. Termasuk ke dalam sensor kimia ini adalah biosensor. Dewasa ini, biosensor telah banyak diteliti dan dikembangkan oleh para peneliti dan industri, dan dalam dunia biosensor research, topik yang sedang berkembang sekarang ini adalah biosensor yang berbasis DNA (genosensor).
Biosensor
Biosensor sendiri didefinisikan sebagai suatu perangkat sensor yang menggabungkan senyawa biologi dengan suatu tranduser. Dalam proses kerjanya senyawa aktif biologi akan berinteraksi dengan molekul yang akan dideteksi yang disebut molekul sasaran. Hasil interaksi yang berupa besaran fisik seperti panas, arus listrik, potensial listrik atau lainnya akan dimonitor oleh transduser. Besaran tersebut kemudian diproses sebagai sinyal sehingga diperoleh hasil yang dapat dimengerti.
Biosensor yang pertama kali dibuat adalah sensor yang menggunakan transduser elektrokimia yaitu elektroda enzim untuk menentukan kadar glukosa dengan metode amperometri. Sejauh ini, biosensor dalam perkembangannya mempunyai tiga generasi yaitu generasi pertama; dimana biosensor berbasis oksigen, generasi kedua; biosensor menjadi lebih spesifik yang melibatkan “mediator” diantara reaksi dan transduser, dan terakhir generasi ketiga; dimana biosensor berbasis enzyme coupling.
Untuk produk-produk komersial dari teknologi biosensor, sekarang ini telah banyak diperjualbelikan. Biosensor eksternal/internal dalam bentuk chip bahkan telah diproduksi oleh perusahaan Amerika i-Stat, MicroChips, Digital Angel, VeriChip yang dapat ditanam dalam tubuh manusia. Beberapa Perusahaan Jepang pun turut berpartisipasi, seperti Matsushita Electric Industrial Co. dengan teknologi biosensornya yang mampu menetapkan secara cepat dan mudah pengukuran kolesterol darah. Tokyo Medical and Dental University dengan biosensor nafasnya yang memanfaatkan enzim monoamine oksidase A (MAO A) dan lain sebagainya. Tetapi secara umum untuk penguna biosensor, hampir 60% pengunanya berasal dari health-care industri.
Prinsip Kerja Biosensor
Pada dasarnya biosensor terdiri dari tiga unsur yaitu unsur biologi (reseptor biologi), transduser, dan sistem elektronik pemroses sinyal. Unsur biologi yang umumnya digunakan dalam mendesain suatu biosensor dapat berupa enzim, organel, jaringan, antibodi, bakteri, jasad renik, dan DNA. Unsur biologi ini biasanya berada dalam bentuk terimmobilisasi pada suatu transduser. Immobilisasi sendiri dapat dilakukan dengan berbagai cara baik dengan (1) adsorpsi fisik, (2) dengan menggunakan membran atau perangkap matriks atau (3) dengan membuat ikatan kovalen antara biomolekul dengan transduser.
Untuk transduser, yang banyak digunakan dalam suatu biosensor adalah transduser elektrokimia, optoelektronik, kristal piezoelektronik, field effect transistor dan temistor. Proses yang terjadi dalam transduser dapat berupa calorimetric biosensor, potentiometric biosensor, amperometric biosensor, optical biosensor maupun piezo-electric biosensor. Sinyal yang keluar dari transduser ini kemudian di proses dalam suatu sistem elektronik misalnya recorder atau komputer.
Berikut adalah contoh skema umum dari biosensor :
Gambar 1. Skema Umum Biosensor
Aplikasi Biosensor
Aplikasi biosensor pada dasarnya meningkat seiring dengan berkembangnya keperluan manusia dan kemajuan iptek. Tetapi secara umum tetap didominasi untuk aplikasi dibidang medis dan lingkungan hidup. Beberapa bidang aplikasi lainnya dapat dilihat pada tabel berikut :
No | Bidang Aplikasi | Kegunaan Biosensor |
1. | Medis dan Farmasi |
|
2. | Lingkungan Hidup |
|
3. | Kimia |
|
4. | Pertanian |
|
5. | Militer |
|
Deteksi Hibridisasi Dalam Biosensor DNA Elektrokimia
1. Disain Biosensor Hibridisasi Elektrokimia
Pemilihan asam nukleat untuk preparasi suatu biosensor berdasarkan DNA terutama bergantung pada apa yang akan di-sense. Misalnya jika tujuan biosensor untuk mendeteksi urutan DNA, suatu ssDNA, biasanya oligonukleotida pendek digunakan sebagai elemen biosensing. Dendrimer dan analog DNA dapat digunakan juga untuk tujuan ini. Dua aspek yang penting dalam pengembangan biosensor hibridisasi: sensitivitas untuk mendeteksi konsentrasi DNA yang serendah mungkin, dan selektivitas untuk dapat mendeteksi titik mutasi. Metode tradisional untuk mendeteksi terjadinya hibridisasi adalah sangat lambat dan memerlukan preparasi khusus. Ini yang menjadi alasan mengapa akhir-akhir ini pengembangan biosensor hibridisasi secara elektrokimia menjadi sangat menarik.
Suatu biosensor hibridisasi DNA elektrokimia pada dasarnya terdiri dari suatu elektrode yang dimodifikasi dengan ssDNA yang disebut probe. Karena elektrode dimodifikasi dengan probe, maka akan menyebabkan interaksi dengan sampel melalui pengenalan urutan komplementernya, di antara yang lainnya, di bawah kondisi pH, kekuatan ion, dan temperatur tertentu. Tahap selanjutnya adalah deteksi pembentukan double helix (Gambar 1).
Tahap-tahap pembuatan biosensor hibridisasi elektrokimia meliputi:
amobilisasi probe, hibridisasi dan deteksi terjadinya hibridisasi. Dalam makalah ini akan dikemukakan mengenai deteksi terjadinya hibridisasi dna antara probe dengan target.
DNA diamobilisasi agar basa-basa dapat mengalami biopengenalan selanjutnya dengan urutan komplementernya. Dalam hal ini, sifat elektrode memainkan peranan yang sangat penting. Bagaimana kompromi basa-basa untuk berinteraksi dengan permukaan elektrode dan selanjutnya mereka dapat membentuk double helix.
Gambar 1. Skema umum tahapan operasi suatu biosensor hibridisasi DNA secara elektrokimia (Rivas et al. 2005).
2. Deteksi Terjadinya Hibridisasi
Kebanyakan strategi untuk deteksi terjadinya hibridisasi adalah berdasarkan: signal redoks asam nukleat yang diamobilisasi pada permukaan elektrode, signal redoks senyawa yang bergabung secara selektif dengan dsDNA, perubahan dalam sifat elektronik dari antarmuka, dan penggunaan skema amplifikasi yang berbeda.
2.1 Berdasarkan Signal Redoks Asam Nukleat
Kelompok Wang (1998c) mengajukan suatu biosensor elektrokimia untuk deteksi DNA Cryptosporydium parvum (29-mer oligonukleotida), berdasarkan penggunaan suatu probe oligonukleotida yang mengandung inosin sebagai pengganti guanin. Suatu inosin hipoksantin dapat berinteraksi dengan sitosin meskipun interaksinya lebih lemah dibanding guanin-sitosin, karena mereka dapat membentuk hanya dua ikatan hidrogen. Terjadinya hibridisasi dievaluasi dari signal oksidasi guanin secara kronopotensiometri, signal berasal dari target. Lucarelli et al. (2002) mengajukan skema untuk deteksi urutan DNA hasil amplifikasi PCR yang berkaitan dengan apolipoprotein E (apoE). Mereka menggunakan oligonukleotida 23-mer yang mengandung residu inosin sebagai probe yang diadsorpsi pada SPE. Pembentukan dupleks dideteksi dari signal oksidasi guanin menggunakan SWV. Rasio terbaik antara signal untuk urutan komplementer dan nonkomplementer diperoleh setelah adsorpsi 15 µg/mL urutan probe selama 2 menit pada potensial 0,50V dalam larutan dengan kekuatan ion yang rendah. Untuk waktu yang kurang dari 10 menit mereka melaporkan selektivitas yang sangat baik,dengan limit deteksi 2,6 x 1011 molekul target dalam larutan sampel 10 µL. Hibridisasi dilakukan pada temperatur ruang selama 10 menit menggunakan larutan hibridisasi 10 mL. Limit deteksi diperoleh 3,0 µg/mL target. Biosensor yang diajukan dapat membedakan dengan jelas antara DNA spesifik unruk apoE dan sampel kontrol negatif, dengan suatu reprodusibilitas 14% untuk oligonukleotida target sintesis dan 15-25% untuk sampel sebenarnya. Suatu pengganggu 50% dapat teramati untuk urutan yang mengandung satu basa mismatch.
Kelompok Thorp melaporkan beberapa penelitian yang berkaitan dengan efek elektrokatalitik Ru(bpy)32+ terhadap oksidasi guanin menggunakan elektrode ITO (Napier dan Thorp 1997a; Aper et al. 1997b; Ontko et al. 1999; Armistead dan Thorp 2000, 2001; Johnston dan Thorp 1996). Napier et al. (1997b) mengajukan suatu biosensor elektrokimia untuk deteksi terjadinya hibridisasi berdasarkan transfer elektron guanin terhadap kompleks logam Ru(bpy)32+.
Suatu urutan probe yang mengandung inosin sebagai pengganti guanin telah digunakan sebagai probe (Napier dan Thorp 1997a). Dalam penelitian ini, efisiensi biosensor untuk penentuan produk PCR telah ditunjukkan untuk pertama kalinya menggunakan DNA genomik dari virus Herpes simplex tipe II (561 pb), Clostridium perfringens (247 bp), dan RNA genomik HIV (3.2 kb), dengan perbedaan yang sangat baik terhadap urutan nonkomplementernya. Napier dan Thorp (1997a) juga menggunakan ITO yang dimodifikasi dengan 1,12-dodecanedicarboxylic acid (DDCA) dan poli(C) untuk mendeteksi hibridisasinya dengan poli(G). Monolayer DDCA mencegah oksidasi langsung guanin sementara elektroaktivitas tinggi untuk Ru(bpy)32+. Penentuan dilakukan dalam 50mM bufer fosfat pH 7.0 dari arus katalitik diperoleh setelah penambahan 200mM Ru(bpy)32+.
2.2. Berdasarkan Penggunaan Indikator Redoks
Kompleks logam dan senyawa organik dapat berinteraksi dengan DNA pada dasarnya berdasarkan dua mode pengikatan, kovalen dan nonkovalen. Dalam mode pengikatan nonkovalen adalah mungkin untuk membedakan interaksi elektrostatik, interkalasi, pengikatan groove, dan ikatan hidrogen (Neidle 1994; Lippard dan Berg 1994).
Kriteria pemilihan indikator redoks adalah berdasarkan selektivitas senyawa dengan dsDNA dibandingkan dengan ssDNA. Bahkan jika beberapa senyawa yang hanya berinteraksi groove dapat digunakan juga untuk deteksi terjadinya hibridisasi (Hashimoto et al. 1994a). Indikator redoks yang paling efisien adalah senyawa-senyawa yang terinterkalasi ke dalam double helix.
2.2.1 Kompleks Logam
2.2.1.a. Kompleks Osmium.
Ju et al. (2003) melaporkan biosensor hibridisasi untuk deteksi fragmen DNA HBV, diamplifikasi PCR menggunakan di(2,2’-bipyridine)osmium (III) ([Os(bpy)2Cl2]2+) sebagai indikator redoks. Penggunaan metodologi ini memungkinkan untuk mendeteksi 8,3 x 10-21 mol DNA HBV genomik asal (dengan voltametri siklik).
Maruyama et al. (2001) mempelajari perilaku beberapa kompleks osmium sebagai indikator hibridisasi. Kompleks [Os(5,6-dmphen)3]2+, (5,6-dmphen ¼ 5,6-dimethyl-1,10-phenantroline) memiliki konstanta pengikatan lebih besar (4,2 x 105 M-1). Dengan keberadaan hibrid pada permukaan elektrode, signal DPV meningkat dari 3,76 µA ke 18,2 µA sementara potensial bergeser dari 600 ke 672 mV. Hibridisasi dilakukan pada 80oC dalam larutan bufer Tris pH 8,5 yang mengandung 1,0M NaCl diikuti dengan tahap pendinginan perlahan hingga 37oC dengan pengadukan selama 90 menit. Setelah itu, elektrode yang mengandung hibrid dicelupkan ke dalam larutan 10mM Tris-HCl + 10mM NaCl yang mengandung 5mM kompleks osmium selama 5 menit. Transduksi dilakukan dalam bufer 10mM Tris-HCl pH 7.0 pada 37oC menggunakan SWV. Respons linier diperoleh dari 6,9 x 10-10 sampai 6,9 x 10-5 g/mL target.
Liu dan Anzai (2004) memperkenalkan PVP-[Os(5,6-dmphen)2Cl]2+sebagai interkalator baru. Senyawa tersebut adalah suatu derivat poli(4-vinilpiridina) yang diturunkan dari kompleks aktif redoks osmium. Probe diperoleh dengan self-assembling suatu 5’-mercaptohexyl-tagged ssDNA pada elektrode emas diikuti dengan penguapan menjadi 6-mercapto-1-hexanol. Hibridisasi dilakukan dengan penambahan oligonukleotida komplementer pada ujung elektrode dimodifikasi probe bertiolasi. Setelah 10 menit interaksi dengan indikator redoks (0,1 mM dalam larutan 9:1 air/etanol), deteksi elektrokimia dilakukan dengan CV dan DPV. Responsnya 1000 kali lipat lebih sensitif dibanding yang diperoleh dengan analog monomer, dengan limit deteksi 0.1pM atau 0.5 amol. Biosensor dapat digunakan kembali setelah dicelupkan dalam bufer Tris-HCl yang mengandung 1mM EDTA pH 8.0 pada temperatur 100oC selama 6 menit.
2.2.1.b. Kompleks Kobalt.
Tris(2,2-bipyridyl)cobalt (III) perchlorate dan tris(1,10-phenantroline)cobalt (III) perchlorate digunakan oleh kelompok Mikkelsen sebagai indikator redoks (Millan et al. 1994). Hibridisasi dilakukan pada temperatur 25oC untuk 50 µL larutan target selama 15 menit pada permukaan elektrode karbon gelas dimodifikasi secara kovalen dengan probe. Kinerja lebih baik diperoleh dengan Co(bpy)33+. Biosensor dapat digunakan kembali minimal 10 siklus setelah denaturasi double helix dengan pemanasan dalam air pada temperatur 100oC selama 10 menit. Wang et al. (Wang et al. 1996c, 1997 g) melaporkan kegunaan Co(bpy)33+sebagai indikator redoks untuk transduksi proses hibridisasi pada CPE dengan PSA. Mereka mendisain dan mengkarakterisasi beberapa biosensor untuk mendeteksi oligonukleotida sintesis yang berkaitan dengan DNA bakteri dan virus (Wang et al. 1996b; 1997d, e; 1999a).
Dalam hal DNA HIV (Wang et al. 1996b), sensor berdasarkan pada penggunaan oligonukleotida pendek (21-mer atau 42-mer single stranded oligonukleotida) dari urutan long terminal repeat (LTR) HIV-1 US yang diamobilisasi pada elektrode pasta karbon atau screen printed. Hibridisasi dilakukan pada temperatur ruang dengan potensial konstan 0,50V selama 5 menit dalam larutan 0.75M NaCl + bufer fosfat 0,020M pH 7.0. Pengikatan Co(phen)33+dilakukan dalam larutan bufer Tris-HCl pH 7,00 yang mengandung 5,0 x 10-5M indikator selama 1 menit pada 0,50 V.
Transduksi dilakukan dalam larutan bufer Tris menggunakan PSA dengan arus
konstan -8,0 µA. Signal analitik diperoleh dari reduksi Co(phen)33+ pada 140 mV. Gambar 2. menunjukkan pengaruh waktu hibridisasi pada signal kronopotensiometri indikator redoks menggunakan 5,0 x 10-7M 21-mer DNA HIV-1 sebagai target. Kronopotensiogram dalam garis putus-putus berkaitan dengan signal dari blanko menunjukkan reduksi indikator redoks yang bergabung dengan ssDNA. Kronopotensiogram dalam garis tebal menunjukkan signal yang diperoleh setelah hibridisasi, dan dalam hal ini indikator terakumulasi dalam double helix tidak hanya secara elektrostatik, tetapi juga dengan interkalasi. Signal analitik adalah perbedaan antara dua signal. Signal hibridisasi meningkat pada awalnya, kemudian berhenti hingga kejenuhan molekul probe yang dapat dicapai pada permukaan elektrode. Limit deteksi setelah 30 menit hibridisasi adalah 4x10-9 M. Suatu pendekatan yang mirip dilaporkan untuk deteksi DNA Mycobacterium tuberculosis menggunakan 27- dan 36-mer oligonucleotida dengan limit deteksi 3,4 x 10-9
M (Wang et al. 1997d). Untuk DNA Cryptosporidium parvum (Wang et al. 1997e) hibridisasi dilakukan dalam 0,5M NaCl + 1.0M guanidin. Limit deteksi dari 100 dan 50 ng/mL diperoleh setelah periode hibridisasi 15 dan 30 menit berturut-turut. Co(phen)33+ juga telah digunakan sebagai indikator redoks untuk deteksi DNA C. parvum menggunakan biosensor hibridisasi DNA SPE yang dapat dihaluskan dan dibarukan dengan limit deteksi dari 20 mg/L target setelah hibridisasi 20 menit (Wang et al. 1998a). Erdem et al. (1999) mengajukan elektrode pasta karbon yang dimodifikasi dengan 21-mer oligonukleotida untuk deteksi DNA HBV menggunakan indikator redoks Co(phen)33+.
Wang dan koleganya (1996d) melaporkan untuk pertama kalinya sifat unik
yang ditunjukkan PNA dalam larutan pada saat diamobilisasi pada permukaan elektrode. Mereka mengevaluasi signal kronopotensiometri untuk reduksi Co(phen)33+
menggunakan dua probe yang berbeda, 15-mer DNA-CPE dan 15-mer PNA-CPE setelah hibridisasi. Dupleks PNA-DNA dapat terbentuk dengan sangat efisien pada kekuatan ion rendah 1mM atau pada temperatur setinggi 50oC, kondisi demikian adalah tidak mungkin untuk memperoleh hibrid DNA/DNA. Berkaitan dengan struktur utama PNA, hibrid PNA-DNA menempel pada permukaan elektrode, seperti dalam larutan, adalah lebih stabil dibanding DNA/DNA. Ini merupakan alasan mengapa PNA digunakan untuk pengembangan beberapa biosensor. Wang et al. (1997h) menggunakan PNA untuk pertama kalinya untuk mengembangkan sensor yang dapat mendeteksi point mutation dalam gen p53. Pada
saat PNA-CPE dan DNA-CPE digunakan dengan urutan DNA non-mutasi, tidakterdapat pengganggu dalam lapisan biopengenal PNA (23,6%), pada varians dengan
satu diperoleh untuk probe DNA di bawah kondisi tersebut, bahkan pada temperatur menyimpang (42oC), menunjukkan bahwa probe PNA dapat membedakan dengan
jelas point mutation.
2.2.1.c. Kompleks Besi.
Takenaka et al. (2000) memperkenalkan penggunaan interkalator ferrocenylnaphtalene diimida. Senyawa ini membentuk suatu kompleks dengan dsDNA yang secara kinetik dan termodinamika lebih stabil dibanding dengan ssDNA. Perilaku indikator redoks ini tidak murni bersifat elektrostatik atau interkalatif, karena potensial formal dari pasangan konstan setelah berinterkalasi dengan ss dan dsDNA. Probe diperoleh dengan menuangi elektrode emas dengan tetesan yang mengandung 200 pmol mercaptohexyl-oligonukleotida selama 2 jam pada temperatur ruang. Hibridisasi dilakukan dengan menempatkan DNA target pada elektrode yang dimodifikasi dengan urutan probe. Kemudian elektrode direndam dalam 1mM larutan interkalator aqueous selama 5 menit, dan setelah dicuci pengukuran dilakukan dalam larutan bufer asetat yang mengandung 40mM KCl.
Voltamogram DPV menunjukkan suatu peningkatan penting dalam arus pada 510 mV deangan keberadaan target, dengan suatu hubungan linier antara 10 dan 60 pmol. Hampir tidak ada perubahan yang teramati setelah interaksi dengan oligo(dT)20 nonkomplementer. Mereka juga mengembangkan metodologi ini untuk mendeteksi DNA plasmid yang diperoleh dari bagian gen transport kolin dalam ragi dengan hibridisasi pada 25oC selama 20 menit. Limit deteksinya 1 fmol, sama seperti untuk oligonukleotida sintesis, yang telah dilaporkan. Tidak terdapat respons yang teramati untuk DNA plasmid yang diperoleh bukan dari gen target.
2.2.2. Senyawa Organik
2.2.2.a. Acridine Orange
Hashimoto et al. melaporkan penggunaan beberapa indikator redoks untuk deteksi terjadinya hibridisasi (Hashimoto et al. 1993, 1994a, b). Penggunaan elektrode grafit yang dimodifikasi probe DNA dan interkalator yang disebut acridine orange telah digunakan untuk deteksi hibridisasi. Bagaimanapun, karena ikatan indikator tidak hanya terhadap dsDNA tetapi juga terhadap ssDNA dan terhadap elektrode secara adsorpsi fisik, sehingga signal hibridisasinya kecil (Hashimoto et al. 1993).
2.2.2.b. Hoestch 33258.
Hoestch 33258 merupakan pengikat groove minor, suatu pewarna aktif secara elektrokmia, digunakan sebagai indikator untuk deteksi DNA oncogene v-myc(Hashimoto et al. 1994a). Suatu DNA 20-mer merkaptoheksil diamobilisasi pada permukaan emas digunakan sebagai urutan probe. Hibridisasi dilakukan pada temperatur 40oC selama 1 jam dalam 0,300MNaCl dan 0,030M natrium sitrat, pH 7,0, sambil diaduk. Signal hibridisasi diperoleh dari arus oksidasi voltametri indikator redoks pada 0,550 V dengan selektivitas yang baik. Limit deteksinya adalah 10-13g/mL untuk pVM623 (4,2 kbp), yang mencakup 4 x 104 copy DNA per mL.
2.2.2.c. Daunomycin.
Senyawa ini banyak digunakan untuk deteksi terjadinya hibridisasi. Hashimoto et al. (1994b) mengevaluasi beberapa interkalator potensial: pewarna acridine, antibiotika antrasiklin dan tetrasiklin, pewarna ethidium, bisbenzimida, dan yang lainnya seperti 7-aminoactinomycin D, chromomycin A3, mithomycin A, olivomycin, vinblastine, propidium iodida, quincacrine mustard, 4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), dan rifampicin. Dalam semua pengerjaan, DNA probe diadsorpsi pada elektrode basal plane pyrolitic graphite (BPPG) yang dihaluskan, selama 30 menit 100oC dan hibridisasi dilakukan pada temperatur 40oC selama 1 jam. Aktivitas potensial senyawa-senyawa sebagai indikator redoks dievaluasi dengan pengukuran pergeseran potensial puncak anodik yang diperoleh pada elektrode modifikasi dsDNA dan dibandingkan dengan elektrode modifikasi ssDNA. Di antara semua senyawa yang diuji, daunomycin adalah yang terbaik, karena menghasilkan pergeseran potensial puncak yang tertinggi. SPE yang dimodifikasi dengan oligonukleotida sintesis dan fragmen DNA yang diekstraksi dari darah manusia dan diamplifikasi PCR digunakan untuk pengujian daunomycin sebagai indikator redoks untuk deteksi polimorfisme apolipoprotein E (Marraza et al. 2000), menunjukkan respons linier hingga 2 mg/L DNA target. Tidak terdapat pengganggu yang teramati dengan urutan nonkomplementer yang mengandung satu mismatch di tengah-tengah urutan. Limit deteksinya adalah 10µM. Biosensor ini dapat digunakan tidak hanya untuk deteksi oligonukleotida sintesis tetapi juga fragmen 244 pb yang mengandung dua kodon polimorfisme, 12 dan 158. Waktu hibridisasi yang lebih lama diperlukan untuk sampel sebenarnya (hingga 8 menit) untuk mengimbangi penurunan kececepatan hibridisasi sebagai konsekuensi dari penembahan panjang rantai. Penentuan yang sangat sensitif dan selektif diperoleh. Marrazza et al. (1999) mengajukan sensor elektrokimia diposable menggunakan 13-mer DNA sintesis yang diamobilisasi pada SPE dengan dua prosedur: adsorpsi langsung oligonukleotida pada permukaan yang di-pretreatment, dan amobilisasi oligonukleotida terbiotinilasi pada SPE modifikasi avidin. Hibridisasi dilakukan pada temperatur ruang dan transduksi dilakukan dengan PSA pada arus konstan dari signal oksidasi kronopotensiometri daunomycin. Limit deteksinya berturut-turut adalah 2 atau 3 µg/mL untuk biosensor yang dipreparasi secara adsorpsi sederhana probe atau interaksi oligonukleotida terbiotinilasi-avidin. Penggunaan daunomycin sebagai indikator redoks juga diajukan oleh kelompok Fang (Sun et al. 1998). Probe DNA 24-mer DNA diamobilisasi secara kovalen pada permukaan emas diderivatisasi dengan monolayer aminoetanatiol secara self-assemble. Dalam penelitian ini signal hibridisasi diperoleh dari arus reduksi daunomycin yang terinterkalasi. Responsnya linier antara 0,1 ng/mL dan 0,1 µg/mL dan limit deteksinya adalah 30 pg/mL. Sampel digunakan sebagai target yaitu DNA sintesis 24-mer dan 400 pb yAl3DNA (komplementer) dan PNC3DNA (nonkomplementer) dengan perbedaan yang sangat nyata.
2.2.2.d. Epirubicin
Epirubicin merupakan obat antikanker yang dapat mengikat DNA melalui interkalasi dan digunakan sebagai indikator redoks untuk deteksi terjadinya hibridisasi (Erdem and Ozsoz 2001). Probe (17-mer oligonukleotida) diamobilisasi dengan adsorpsi pada CPE. Hibridisasi dilakukan dengan mencelupkan elektrode ke dalam larutan target selama 5 menit pada potensial 0,50V. Dengan keberadaan double helix, signal DPV adalah lebih kecil dikarenakan shielding dari gugus yang dapat dioksidasi setelah interkalasi. Hampir tidak ada perubahan dalam respons voltametrik yang diperoleh, dibandingkan dengan blanko.
2.2.2.e. Methylene Blue
Senyawa ini adalah pewarna 3,7-bis (dimethylamino)phenothiazine-5-ium-chloride (methylene blue, MB) yang dapat berinterkalasi dengan DNA (Kelley et al. 1997, 1999). Kerman et al. (2002) melaporkan penggunaan senyawa ini untuk deteksi terjadinya hibridisasi. Dalam satu kasus (Kerman et al. 2002) probe merupakan oligonukleotida yang terikat secara kovalen terhadap residu karboksilat yang berasal dari lapisan tiolasi yang diamobilisasi pada permukaan emas yang sebelumnya diaktivasi dengan N-hidroksisuksinimida dan karbodiimida. Signal hibridisasi diperoleh dari penurunan arus reduksi MB yang menggambarkan inhibisi sterik dari gugus MB tereduksi yang dipak antara bulky double helix hibrid. Penggunaan MB juga diajukan untuk deteksi voltametri urutan DNA yang berkaitan dengan virus TT dan HBV (TT adalah inisial untuk pasien pertama yang terinfeksi virus ini) dari sampel sebenarnya yang diamplifikasi PCR (Meric et al. 2002). Probe dibuat secara adsorpsi pada CPE dengan 21- dan 24-mer oligonukleotida HBV dan TTV, berturut-turut. MB juga digunakan oleh kelompok Fang (Zhu et al. 2004) untuk deteksi terjadinya hibridisasi pada permukaan elektrode emas dimodifikasi zirkonium oksida. Hibridisasi dilakukan pada temperatur ruang selama 30 menit dengan mencelupkan elektrode termodifikasi dengan probe ke dalam larutan hibridisasi dengan
pengadukan, yang mengandung DNA target. Interkalasi terjadi dalam larutan 2,0x10-5 M MB selama 5 menit dengan sirkuit terbuka. Deteksi elektrokimia dilakukan secara DPV dari signal reduksi pada 20,20V. Arus menurun secara linier dengan logaritma dari DNA target 2,25 x 10-10 hingga 2,25 x 10-8M, limit deteksinya 1,0 x 10-10M. Ozkan et al. (2002) menujukkan bahwa dengan DNA-CPE, MB dapat digunakan sebagai penanda redoks untuk deteksi hibridisasi pada CPE yang dimodifikasi PNA. Mereka mempelajari interkalasi MB dengan PNA pada elektrode merkuri dan CPE dengan kombinasi adsorptive transfer stripping voltammetry, alternating current voltammetry, dan differential pulse voltammetry.
2.2.2.f. Hemin.
Kara et al. (2002) mengajukan penggunaan hemin, suatu kompleks besi porfirin, sebagai indikator redoks, yang dihubungkan dengan penggunaan suatu GCE dan DPV. Interaksi hemin dengan ss dan dsDNA diikuti dari arus reduksinya dalam larutan bufer asetat 0,50M yang dideoksigenasi, pH 4,80, mengandung 20 mM NaCl. Penurunan arus ini diamati setelah interkalasi dengan dsDNA karena tersembunyinya bagian molekul yang dapat tereduksi.
2.3. Berdasarkan Perubahan Sifat Listrik Film
Perubahan dalam beberapa sifat intrinsik double helix seperti konduktivitas, kapasitansi, atau impedansi dapat digunakan untuk evaluasi pembentukan double helix.
Kelompok Wang (Wang et al. 1999b) mengajukan pendekatan menarik dan bebas penanda berdasarkan pada doping probe asam nukleat langsung ke dalam film polipirol. Matriks polimer dielektrogenerasi secara potensiodinamika pada GCE menggunakan 0,05M pirol + 100µg/mL larutan probe oligonukleotida. Hibridisasi dilakukan dalam larutan 0,1M glisin/0,1M NaCl pada 0.15V dibawah kondisi dimana oligonukleotida anionik hanya sebagai dopant. Signal hibridisasi diperoleh pada 0,15V menggunakan polipirol yang dibuat dalam keberadaan oligo(dG)20 dan oligo(dA)20. Setelah penambahan urutan komplementernya, respons negatif diperoleh, yang ditandai dengan naiknya densitas muatan dan ukuran dopant asam nukleat terhadap hibridisasi, begitu pula perubahan konduktivitas polimer. Dengan keberadaan urutan nonkomplementer signal ini positif dan berkaitan dengan perubahan konduktivitas yang berhubungan dengan repulsi elektrostatik atau adsorpsi.
Strategi yang lain untuk deteksi secara elektrokimia oligonukleotida pendek terdiri dari penggunaan suatu permukaan terstabilisasi membran lipid bilayer dari fosfatidilkolin telur yang dipreparasi pada elektrode perak yang dilapisi dengan suatu lapisan polimer dan kemudian dicelupkan ke dalam 0,1M KCl (Krull et al. 2000). ssDNA dimodifikasi dengan karbon alifatik C16 menghasilkan suatu kenaikan densitas muatan negatif pada permukaan membran, menandakan sifat biopengenal. Percobaan dengan label fluorescein dT20-C16 menunjukkan bahwa reduksi dalam arus gabungan teramati setelah penambahan dA20 berkaitan dengan pelepasan double helix.
Vagin et al. (2003) mengajukan penggunaan elektrode emas yang dimodifikasi dengan surfaktan yang disebut Brij-52. Probe DNA dipreparasi dengan menetesi emas dengan 5µL larutan etanolat Brij-52, diikuti dengan evaporasi pelarut. Selanjutnya, elektrode dibiarkan untuk berinteraksi dengan probe oligonukleotida yang mengandung rantai hidrokarbon panjang, C16pdT5, yang terakumulasi ke dalam daerah hidrofobik bilayer surfaktan. Signal yang diperoleh dari pengukuran impedansi pada 0,1 V vs. Ag/AgCl, 1MKCl pada temperatur ruang merupakan dari penurunan komponen sebenarnya. Penurunan ini pada frekuensi tinggi berkaitan dengan resistensi membran seiring kenaikan kapasitansi dari violasi lokal inner bilayer.
2.4. Berdasarkan Penggunaan Skema Amplifikasi Signal
Suatu kesempatan yang sangat menarik untuk meningkatkan sensitivitas pengujian untuk deteksi terjadinya hibridisasi adalah amplifikasi signal. Daftar publikasi panjang yang mendukung strategi baru yang penting ini telah dihasilkan. Kelompok Willner mempresentasikan penggunaan liposom bertanda sebagai probe untuk amplifikasi proses sensing DNA dan memperoleh informasi tentang terjadinya hibridisasi secara Faradaic impedance spectroscopy, quartz crystal microbalance, dan pengukuran secara elektrokimia (Patolsky et al. 2000; Alfonta et al. 2001; Patolsky et al. 2001) (Gambar 3). Dalam satu kasus, oligonukleotida sulfanilheksil yang mengandung 13 basa ditempelkan pada elektrode emas, diikuti dengan hibridisasi dengan DNA target (Patolsky et al. 2000). Pada saat hibrid terbentuk, struktur yang dihasilkan berinteraksi dengan liposom yang dilabel dengan oligonukleotida lain yang berkomplementer terhadap salah satu bagian target. Liposom (220 nm) tersusun dari asam fosfatidat, fosfatidilkolin, maleimida-fosfatidiletanolamin, dan kolesterol. Tiap liposom mengandung 50-60 unit oligonukleotida yang menyumbangkan densitas muatan negatif terhadap permukaan.
Kalium ferrisianida/ferrosianida digunakan sebagai penanda redoks yang ditolak oleh
muatan negatif liposom, konsekuensinya meningkatkan resistensi transfer muatan dari 3 kW pada emas yang mengandung probe hingga 4,5 kW setelah pembentukkan duplex, dan 15 kW setelah penggabungan liposom. Limit deteksinya adalah 1,2 x 10-12M atau 6 x 10-16
mol dalam sampel analit dan selektivitas untuk oligonukleotida dengan 6 mutasi sangat ekselent.
Dalam konfigurasi yang lain penulis menggunakan liposom bermuatan negatif berlabel biotin. Dalam hal ini, liposom tersusun dari fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, kolesterol, dan fosfatidil etanolamin terbiotinilasi yang berlabel residu biotin (550 unit biotin per liposom). Kelebihan prosedur ini adalah dapat menaikkan amplifikasi, karena setelah asosiasi avidin/liposom terbiotinilasi resistensi naik hingga 17 kW dan 20 kW. Dengan dua kali tahap memungkinkan untuk mendeteksi 5 x 10-14 M atau 2,5 x 10-17 mol dalam sampel analit. Penggunaan liposom berlabel biotin dan HRP untuk mengamplifikasi signal juga diajukan (Alfonta et al. 2001). Liposom dimodifikasi biotin dan HRP diamobilisai pada temperatur ruang diikuti dengan reaksi denag 4-kloro-1-naftol (1 x 10-3M) plus 1,5 x 10-4M hidrogen peroksida. Perubahan dalam resistensi transfer elektron digunakan sebagai signal analitik, limit deteksinya adalah 6,5 x 10-13M.
Alternatif lain adalah penggunaan liposom yang mengandung oligonukleotida yang menjadikan terbentuknya struktur dendritis (Patolsky et al. 2001). Penulis mengajukan penggunaan liposom yang dimodifikasi dengan oligonukleotida komplementer terhadap bagian DNA target. Prosedur dimulai dengan amobilisasi probe pada permukaan emas, diikuti dengan hibridisasi pada permukaan elektrode, menyisakan bagian bebas untuk berinteraksi dengan liposom berpenanda DNA.
Pendekatan lain adalah berdasarkan penggunaan oligonukleotida terbiotinilasi untuk
membentuk double helix yang akan kembali berhidridisasi dengan probe. Selanjutnya, pada saat target terikat terhadap oligonukleotida terbiotinilasi berhibridisasi dengan urutan probe, avidin ditambahkan untuk bergabung dengan liposom terbiotinilasi. Dalam hal ini, penambahan avidin dan liposom memungkinkan untuk terbentuknya struktur dendritis yang dapat mendeteksi 1 x 10-13M DNA target.
Lumley-Woodyear et al. (1996) mengajukan deteksi terjadinya hibridisasi menggunakan poli(deoksitimidin)-5’-fosfat (pd(T)25-30) sebagai probe dan poli(deoksiadenosin)-5’-fosfat (pd(A)25-30) dilabel dengan target horseradish peroxidase. Deteksi dilakukan pada 0,0 V vs Ag/AgCl dari reduksi Os3+ yang dihasilkan selama regenerasi enzimatis. Respons untuk urutan nonkomplenter sekitar 5% dari urutan komplementer. Caruana et al. (1999) juga mengajukan penggunaan elektrode dengan diameter 7 µm dimodifikasi dengan suatu polimer Os. Penentuan dilakukan pada 20,06 V setelah penambahan target yang dilabel dengan soybean peroxidase (SBP). Kontak listrik antara SBP dan elektrode didasarkan melalui polimer redoks, yang dapat mereduksi elektrokatalitik hidogen peroksida. Di bawah kondisi ini memungkinkan untuk deteksi 40.000 copy dan membedakan mismatch basa tunggal dalam oligonukleotida 18-mer. Pendekatan lain dilaporkan penggunaan elektrode karbon yang dimodifikasi dengan polimer osmium dan avidin, dimana urutan probe terbiotinilasi diamobilisasi (Campbell et al. 2002). Hibridisasi dilakukan selama 30 menit diikuti dengan penggabungan urutan berlabel horseradish peroxidase (setelah inkubasi 15 menit).
Signal analitik merupakan arus katalitik pada 0,0 V vs. Ag/AgCl berkaitan dengan reduksi 1mM hidrogen peroksida. Analit adalah E. coli 16S rRNA (60 basa). Telah
dilaporkan pula kemungkinan deteksi urutan komplementer dalam keberadaan DNA salmon dan serum kambing. Kemajuan berarti dalam deteksi DNA target dibandingkan dengan hasil sebelumnya diperoleh dengan penggunaan uji sandwich-type-enzyme-amplified (Zhang et al. 2003). Limit deteksinya adalah 0,5 fM yang dicapai dengan konfigurasi ini. Mereka menggunakan GCE 10 µm dimodifikasi dengan PAA-PVP-Os. Hibrid yang dihasilkan diuapkan terhapap oligonukleotida 18-mer berlabel 10nM HRP, dan deteksi terjadinya hibridisasi dilakukan secara amperometri pada 0,12 V dalam larutan PBS setelah penambahan 1mM hidrogen peroksida. Respons linier antara ujung 5 dan 200 zmol (3000 hingga 12000 copy) target. Hal ini memungkinkan untuk mengukur 0,5 fM DNA, yaitu sekitar 3000 copy dalam 10 µL droplet. Penukaran HRP dengan bilirubin oksidase, suatu enzim yang mengkatalisis reduksi oksigen sekitar terhadap air, menghasilkan skema lebih sederhana dengan sensitivitas tinggi dalam penentuan DNA Shigella flexneri, dalam hubungannya dengan polimer PAA-PVP-Os dan 10-µm GCE (Zhang et al. 2004). Dalam hal ini deteksi terjadi dalam level femtomolar, 10-15M dalam 5 µL larutan, sama dengan limit deteksi sebelumnya yang diajukan oleh penulis yang sama menggunakan HRP.
Suatu lapisan sensing untuk deteksi terjadinya hibridisasi diperoleh dengan deposisi secara bertahap dari polielektrolit telah dilaporkan oleh Domı´nguez et al. (2004). Penulis menggambarkan keberhasilan pelabelan oligonukleotida dengan enzim sebagai rute baru untuk amplifikasi signal hibridisasi dengan tahapan hibridisasi bertingkat. Biosensor dipreparasi secara self assembling dari poli[(vinil-piridin)Os(bpy)2Cl] kationik pada elektrode emas diikuti dengan penggabungan HRP anionik yang dimodifikasi secara kimia dan suatu lapisan baru dari polimer redoks. Ketika struktur terbentuk, DNA terikat secara kovalen melalui gugus fosfat 3’. Tahap berikutnya merupakan titik kunci dari rute baru berkaitan dengan penggabungan GOx yang dimodifikasi dengan banyak oligonukleotida yang membuat kemungkinan transduksi langsung dari terjadinya hibridisasi dan amplifikasi dengan tahap hibridisasi bertingkat. Dalam hal ini, setelah penambahan glukosa, dihasilkan hidrogen peroksida, dimana setelah difusi cepat, dapat dideteksi dengan amobilisasi HRP dekat permukaan elektrode. Urutan dari tahap hibridisasi dapat diulang mengikuti bangunan arsitektur dendritis yang menjadikan peningkatan penting dalam sensitivitas. Metodologi ini mendapatkan kuantifikasi oligonukleotida 44-mer pada level 1 nM setelah 30 menit hibridisasi. Suatu metode biosensing elektrokimia berdasarkan pembentukan pasangan avidin-fosfatase basa terhadap oligonukleotoda terbiotinilasi telah dilakukan oleh Xu et al. (2001). Transduser adalah suatu elektrode lapisan emas fotolitografi yang dimodifikasi dengan DNA 20-mer dari bagian segmen DNA antigen B core hepatitis, dimodifikasi dengan suatu gugus merkaptoheksil pada ujung 5’-nya. Hibridisasi dilakukan dalam mikrosel (150 µL) yang berisi DNA komplementernya yang terbiotinilasi pada temperatur 37oC selama 1 jam. Setelah hibridisasi berhenti, elektrode diinkubasi selama 15 menit dengan avidin-fosfatase basa, dengan keberadaan a-naftilfosfat, yang tertransformasi dalam a-naftol elektroaktif. Arus puncak oksidasi a-naftol digunakan sebagai signal analitik. Dengan menggunakan sampel DNA plasmid HBV, limit deteksinya adalah 0,22 nmol/L (30 fmol dalam 5 µL sampel). Hanya masalah dalam metodologi ini adalah selektivitas, karena mismatch 3 basa mengganggu 7,5% sementara mismatch 2 basa sebesar 47,6%. Kim et al. (2003) mengajukan penggunaan dendrimer ferrocenyl-tethered poly(amido-amine) (FcD) secara parsial sebagai elektrokatalis untuk amplifikasi deteksi terjadinya hibridisasi. Probe terikat secara kovalen terhadap dendrimer dan berhibridisasi dengan DNA target 31-mer pada temperatur ruang selama 2 jam. Dalam tahap berikutnya, oligonukleotida terbiotinilasi bergabung dengan struktur secara sandwich-type. Kemudian, konjugat avidin-alkaline fosfatase bergabung dengan struktur dan p-aminofenil fosfat yang berkonversi secara enzimatis menjadi p-aminofenol, dimana setelah terdifusi mendekati lapisan FcD secara elektrokatalitik teroksidasi menjadi quinoimida. Arus elektrokatalitik yang dimonitor secara voltametri siklik merupakan signal hibridisasi. Limit deteksinya adalah 20 fmol.
Biosensor diuji dengan target yang mengandung mismatch satu basa dan arus elektrokatalitiknya yaitu 22,7% dari satu yang diperoleh dengan komplementer target. Mereka menemukan penurunan bertahap respons elektrode setelah pengulangan percobaan terutama berkaitan dengan peningkatan deaktivasi enzim yang terikat. Pividori et al. (2003) melakukan deteksi amperometri dari amplikon dihubungkan dengan urutan spesifik DNA IS200 Salmonella spp (probe 292 pb probe dari IS200 ujung 5’). Hibridisasi dengan target terbiotinilasi dilakukan pada temperatur 42oC dalam volume larutan 150 µL selama 45 menit. Kemudian pelabelan dengan inkubasi konjugat enzim, HRP-streptavidin pada temperatur 42oC dan penentuan secara amperometri dilakukan pada 20,10 V dalam keberadaan hidroquinon setelah penambahan 1,06 mM hidrogen peroksida.
2.5. Berdasarkan Penggunaan Permukaan yang Berbeda untuk Hibridisasi dan Deteksi
Sesuatu yang baru, menarik, dan strategi yang sangat inovatif untuk keberhasilan yang tinggi deteksi terjadinya hibridisasi telah dilaporkan dalam tahun terakhir. Pada dasarnya, hal tersebut berdasarkan penggunaan dua permukaan yang berbeda, satu untuk melakukan hibridisasi dan yang lainnya untuk deteksi terjadinya hibridisasi. Kombinasi ini membiarkan pilihan dari permukaan yang paling baik untuk melakukan hibridisasi dan satu lagi yang paling baik untuk melakukan penentuan secara elektrokimia. Dengan cara ini, adalah memungkinkan untuk untuk menganalisis DNA secara sangat sensitif dan selektif.
2. 5.1. Berdasarkan Deteksi Basa-Basa Secara Elektrokimia
Kelompok Palecek (Palecek et al. 2002c) mengajukan penggunaan magnetic beads yang dapat dibeli, yang diderivatisasi dengan oligo(dT)25 untuk melakukan hibridisasi dalam volume yang sama 0,2M NaCl dan 50mM bufer fosfat pH 7,0, pengadukan selama 30 menit. Setelah hibridisasi dan pencucian, DNA dilepaskan dari magnetic bead dengan pemanasan pada temperatur 85oC selama 2 menit dalam 20 µL air trides. Depurinasi dilakukan dalam larutan HClO4 panas selama 30 menit. Setelah dingin dan netralisasi, larutan yang dihasilkan ditambahkan terhadap elektrolit pendukung untuk dideteksi secara elektrokimia. Hal itu dilakukan dalam dua arah, satu difokuskan pada penentuan basa dengan sensitivitas tinggi pada merkuri, melalui pembentukkan senyawa sedikit larut, dan yang lainnya berdasarkan penggunaan oligonukleotida berlabel osmium tetroksida, 2,2’-bipiridina. Dalam hal ini, signal hibridisasi diperoleh dari evolusi hidrogen katalitik dalam keberadaan osmium. Penggunaan material karbon untuk penentuan oksidasi residu G dan A atau DNA target modifikasi Os-bpy juga telah dilaporkan.
Wang et al. (2002a) mengajukan deteksi elektrokimia terjadinya hibridisasi yang bebas-label dari deteksi nukleobasa dengan keberadaan tembaga. Protokol untuk deteksi gen kanker payudara BRCA terdiri dari penempelan 19-mer oligonukleotida dengan substitusi inosin terbiotinilasi terhadap streptavidin yang ditutupi magnetic bead, diikuti dengan hibridisasi. Setelah pemisahan magnetik, magnetic beads disuspensikan dalam NaOH selama 5 menit, dipindahkan ke dalam sel untuk penghancuran asaam dengan keberadaan 3M asam sulfat, dan kemudian dipanaskan hingga kering. Setelah kering, residu disuspensikan dalam 0,5M asetat pH 5,9 dan 2 mg/L larutan tembaga(II) (pH akhir 4,8) dimana deteksi elektrokimia dilakukan menggunakan elektrode grafit. Kronopotensiogram menunjukkan dua proses, satu pada 0,87 V dan yang lainnya pada 1,18 V, untuk oksidasi guanin dan adenin berturut-turut. Signal naik dengan besar dengan keberadaan tembaga karena terbentuknya kompleks Cu(I). Puncak oksidasi guanin naik 16- dan 31- kali lipat dengan keberadaan 2 dan 4 mg/L tembaga berturut-turut. Limit deteksinya adalah 250 pg atau 40 fmol dalam 50 µL volume sampel.
Wang et al. (2003a) mengajukan penggunaan GCE dimodifikasi dengan MWCNT sebagai suatu detektor dari gen kanker payudara BRCA1. Keberadaan nanotube karbon menghasilkan cara yang efisien untuk amplifikasi deteksi bebas- label secara elektrokimia untuk hibridisasi DNA. Kombinasi penghancuran sampel DNA dengan keberadaan tembaga, menghasilkan signal hibridisasi yang baik yang diperoleh dalam rentang 50–250 µgL-1 setelah 20 menit hibridisasi. Limit deteksinya adalah 40 ng/mL, 2 ng, atau 100 fmol dalam 50 µL larutan hibridisasi.
2. 5.2. Berdasarkan Pada Deteksi Partikel Logam Yang Terikat Pada Hibrid
Katz, Willner dan Wang (2004) mempresentasikan suatu review tentang penelitian dengan penggunaan logam, semikonduktor, dan partikel magnetik sebagai unit fungsional untuk aplikasi elektroanalitik. Wang (2003) meringkas kemajuan terkini dalam perkembangan pasangan nanopartikel/polinokleotida baru untuk peningkatan deteksi urutan spesifik DNA secara listrik.
2.5.2.a. Deteksi Emas.
Wang et al. mempresentasikan penggunaan stripping logam untuk pertama kalinya (Wang et al. 2001a) untuk deteksi urutan DNA dari gen kanker payudara BRCA 1 menggunakan penanda emas koloidal. Protokolnya terdiri dari:
a) amobilisasi oligonukleotida probe terbiotinilasi pada magnetic beads modifikasi avidin; b) Hibridisasi; c) Interaksi dengan nanopartikel logam dilapisi streptavidin; d) Pelarutan emas dalam 1MHBr + 0.1mMBr2; e) Prekonsentrasi emas pada elektrode screenprinted dengan penerapan 20,8 V selama 2 menit; f) Deteksi elektrokimia dalam larutan 1MHBr + 0.1mM Br2 secara PSA pada arus konstan 5,0 µA. Limit deteksinya adalah 100 g/mL atau 5 ng dalam 50 µL sampel.
2.5.2.b. Deteksi Perak.
Kemajuan yang ekselent dalam sensitivitas dilaporkan dengan melibatkan tahap deposisi perak setelah interaksi dengan partikel emas-streptavidin (Wang et al. 2001b). Dalam hal ini, penentuan kronopotensiometri dilakukan secara PSA pada SPE setelah pelarutan perak yang terdeposit dalam asam nitrat. Limit deteksinya adalah 0,2 ng/mL, 32 pM, 10 pg, atau 1,5 fmol dalam 50µL larutan hibridisasi. Suatu skema menarik berdasarkan penggunaan deteksi stripping elektrokimia padatan yang diinduksi secara magnetik dari penanda logam juga diajukan sebagai suatu alternatif untuk menurunkan jumlah tahapan dalam deteksi bagian gen kanker payudara BCRA 1 (Wang et al. 2002b). Protokol berdasarkan pengumpulan magnetic bead yang mengandung hibrid dan presipitasi perak pada SPE. Medan magnet membuat agregat partikel DNA logam pada permukaan elektrode setelah tahap hibridisasi. Signal kronopotensiometri yang sangat baik dari akumulasi perak teramati pada 0,28 V. Suatu signal dengan 12 kali lipat lebih kecil, dibandingkan dengan urutan komplementer, teramati untuk DNA dengan mismatch basa tunggal. Limit deteksinya adalah 150 pg/mL atau 1,2 fmol diperoleh setelah 30 menit hibridisasi. Reprodusibilitas pengujian adalah sebesar 7%.
Strategi lain adalah berdasarkan deposisi besar-besaran perak dalam struktur DNA, dengan cara yang sama dengan yang digunakan ketika menggenerasi templat DNA dari nanokawat logam (Braun et al. 1998). Pada saat double helix terbentuk, kemudian dicelupkan dalam larutan yang mengandung Ag+ dan hidroquinon. Dalam hal ini, ion perak terikat pada backbone DNA bermuatan negatif secara interaksi elektrostatik dan dalam keberadaan hidroquinon mereka terdeposit sepanjang DNA. Setelah pelarutan dalam larutan asam nitrat, perak yang terdeposit direoksidasi pada permukaan elektrode. Signal oksidasi ini digunakan untuk mengevaluasi terjadinya hibridisasi.
Protokol tediri dari:
a) Amobilisasi probe terbiotinilasi pada streptavidin-modified magnetic beads,
b) Hibridisasi dengan target terbiotinilasi
c) Interaksi dengan nanopartikel emas koloidal dilapisi streptavidin,
d) Pengendapan perak,
e) Pelarutan partikel perak,
f) Deposisi perak terlarut pada SPE, dan
g) Analisis stripping kronopotensiometri dari logam terdeposisi.
Wang et al. (2003b) melaporkan suatu protokol baru untuk deteksi hibridisasi DNA menggunakan DNA sebagai templat metalisasi. Protokol baru ini terdiri dari modifikasi emas dengan cystamine diikuti dengan amobilisasi probe DNA dengan pengikatan kovalen dengan karbodiimida. Setelah penghilangan DNA nonspesifik yang teradsorpsi, hibridisasi dilakukan dalam larutan bufer foafat 0,05M, pH 7,6, selama 30 menit pada temperatur ruang. Pada saat DNA nonhibridisasi dihilangkan, perak dikumpulkan secara elektrostatik pada hibrid dan setelah presipitasi dalam keberadaan hidroquinon, dilarutkan dan dikuantifikasi dalam asam nitrat 0,1M/kalium nitrat 0,1M secara PSA pada SPE yang dipretreatment. Sensor dievaluasi dalam kaitannya dengan urutan DNA kanker payudara BCRA 1. Limit deteksinya adalah 100 ng/mL atau 5 ng dalam 50 µL larutan hibridisasi.
2.5.2.c. Deteksi Besi.
Terjadinya hibridisasi juga dideteksi dengan pengukuran stripping runutan besi. Wang et al. (2003c) mengajukan dua protokol yang melibatkan penentuan besi, pertama berdasarkan pelabelan probe dengan nanopartikel besi dilapisi emas, dan kedua berdasarkan deteksi besi yang terdapat dalam penanda magnetic-sphere mikroskopik. Dalam kasus pertama target terbiotinilasi diamobilisasi pada magnetic bead, diikuti dengan hibridisasi dengan probe berlabel partikel besi/emas dan pelarutan emas dalam larutan 1M HBr + 0.1mM Br2 dalam larutan bufer pH 9,0, yang mengandung 20 µM nitroso naftol dan 40mM kalium bromat (digunakan untuk amplifikasi signal). Besi dideposit pada 20,05 V pada suatu hanging mercury drop electrode dan dideteksi secara DPV. Dalam kasus kedua, hibridisasi dilakukan dalam microwell modifikasi chitosan. Pada saat hibridisasi dilakukan, partikel yang mengandung besi dilarutkan dan besinya dikuantifikasi dengan cathodic stripping voltammetry dengan keberadaan 1-nitroso-2-naftol dan bromat. Pengujian menjadi alternatif baru untuk deteksi terjadinya hibridisasi.
2.5.2.d. Cadmium Sulfida.
Wang et al. melaporkan untuk pertama kalinya penggunaan nanopartikel anorganik biner seperti koloid CdS untuk deteksi terjadinya hibridisasi berdasarkan penentuan kronopotensiometri sensitif terhadap runutan cadmium terlarut (Wang et al. 2002c). Protokol yang diajukan meliputi: a) Pengikatan target terbiotinilasi terhadap magnetic bead yang tertutup oleh streptavidin, b) Interaksi dengan probe yang dilabel CdS, c) Pelarutan nanopartikel dalam larutan HNO3 1M; dan d) Penentuan kronopotensiometri dari ion cadmium terlarut pada film merkuri GCE. Signal cadmium yang bagus diperoleh pada -0,52 V dengan perbedaan yang jelas terhadap urutan nonkomplementer dalam kelebihan yang besar. Limit deteksinya adalah 20 ng/mL atau 100 fmol dalam 50 µL sampel. Patolsky et al. (2003) melaporkan dengan kekecualian limit deteksi yang rendah untuk DNA virus menggunakan partikel magnetik dimodifikasi asam nukleat., dalam hubungannya dengan chemiluminiscence sebagai mode transduksi. Skemanya terdiri dari tahap-tahap berikut: a) Modifikasi partikel magnetik 5 mm dengan primer bertiolasi menggunakan ester cross-linker 3-maleidopropionicacid N-hydroxysuccinimide heterobifungsional; b) Hibridisasi dengan ssDNA M13 F (7229 basa); c) Polimerisasi dengan keberadaan campuran dGTP, dATP, dCTP, dan suatu dUTP terbiotinilasi. Selanjutnya, setelah polimerisasi sejumlah besar unit biotin diperkenalkan; d) Interaksi dengan konjugat avidin-HRP; e) Interaksi dengan partikel magnetik modifikasi naftoquinon; f) Pembentukan hidrogen peroksida dengan penerapan potensial untuk mereduksi naftoquinon, O2 dapat direduksi secara elektrokatalitik menjadi H2O2. Oksidasi luminol dengan hidrogen peroksida terelektrogenerasi dihasilkan dalam chemiluminiscence dan emisi cahaya. Intensitas cahaya yang dipancarkan meningkat dalam hubungan yang linier dengan w2 ketika partikel magnetik diputar. Limit deteksinya adalah 8,3 x 10-18M atau 50 copy per 10 µL.
Wang et al. (2003c) mengajukan suatu skema efektif untuk amplifikasi hibridisasi DNA berdasarkan penggunaan elektrode single wall carbon nanotubes (SWCNT) membawa partikel CdS dikombinasikan dengan deteksi stripping voltammetric dari penanda CdS terlarut. Nanotube yang diaktivasi didispersikan dalam toluena untuk dicampurkan dengan CdS termodifikasi oligonukleotida. Setelah inkubasi 4 jam dilakukan pengadukan dan pemisahan nanopartikel yang tak terikat dan penghilangan toluena, CNT diaduk dengan streptavidin dan oligonukleotida terbiotinilasi yang disebut probe 2. Probe 1 terbiotinilasi ditambahkan pada keping uji streptavidin dan hibridisasi dilakukan pada temperatur ruang setelah penambahan probe 2-coated-SWCNT-CdS-streptavidin. Setelah 1 jam CdS dilarutkan dalam asam nitrat 1M. Penentuan elektrokimia dari kadmium dilakukan pada elektrode film merkuri-karbon gelas secara SWV. Di bawah kondisi ini limit deteksinya adalah 40 pg/mL atau 330 amol dalam 50 µL larutan.
Kelompok Wang (2003d) melaporkan suatu deteksi DNA multitarget ssecara elektrokimia berdasarkan penggunaan koloid anorganik lain, penanda (quantum dots, QD). Biosensor ini digunakan untuk deteksi tiga oligonukleotida sintesis 60-mer yang berbeda yang berkaitan dengan gen kanker payudara BRCA1, dan hal tersebut berdasarkan pada penggunaan tiga nanopartikel encapsul, CdS, PbS, dan ZnS. Setelah hibridisasi dengan target DNA dan hibridisasi selanjutnya dengan probe berlabel QD, QD dideteksi secara stripping DPV pada elektrode film merkuri. Signal diperoleh pada 21,12 V, 20,68 V, dan 20,53 V untuk Zn, Cd dan Pb, berturut-turut.
2.5.3. Berdasarkan Pada Deteksi Marker Redoks Yang Terjebak Dalam Microstyrene Bead Yang Terikat Pada Hibrid
Pendekatan lain yang menarik untuk penentuan terjadinya hibridisasi dengan sensitivitas tinggi adalah berdasarkan penggunaan penanda microstyrene microbead secara internal didahului dengan marker elektroaktif ferrocenecarboxaldehyde (FCA) (Wang et al. 2003e). Suatu microsphere yang mengandung 5 x 1011 molekul FCA yang tertutup neutravidin yang membuat interaksi dengan target terbiotinilasi dan kemudian berhibridisasi dengan probe terbiotinilasi yang diamobilisai pada magnetic bead. Marker dideteksi dari signal kronopotensiometri yang diperoleh pada 0,88V menggunakan GCE. Limit deteksinya adalah 1 pg/L, sekitar 10-16M atau 5,1 x 10-21 mol, atau 31.000 molekul dalam 50 µL sampel. Microsphere target-labeled-gold-loaded-polystyrene juga digunakan untuk deteksi terjadinya hibridisasi (Kawde et al. 2004). Signal yang ditingkatkan menggunakan presipitasi emas katalitik pada nanopartikel emas yang terdapat dalam hibrid atau menggunakan format sandwich. Transduksi elektrokimia diperoleh dengan oksidasi dari emas yang dielektrodeposisi. Di bawah kondisi tersebut diperoleh limit deteksi 6 pM atau 2 pg atau 300 amol dalam 50 µL sampel.
2.5.4. Berdasarkan Deteksi Produk Enzimatis Menggunakan Enzim-Enzim Yang Diikat Terhadap Hibrid
Suatu uji genomagnetik berdasarkan pada pembentukan pasangan alkalin fosfatase terhadap hibrid dan penggunaan SPE untuk melakukan penentuannya dilaporkan oleh kelompok Wang (Wang et al. 2002d). Konjugat microsphere yang berhibridisasi berinteraksi dengan streptavidin-alkaline fosfatase selama 25 menit dan transduksi dilakukan setelah penambahan substrat yaitu suatu naftil fosfat dari produk oksidasi enzimatis, a-naftol. Limit deteksinya adalah 10 ng/L setelah 20 menit hibridisasi atau 500 pg dalam 50 mL sampel. Protokol ini ditingkatkan untuk penentuan simultan dari dua target DNA (Wang et al. 2002e). Bentuk ini berdasarkan pada suatu isolasi magnetik dari duplex DNA dan amplifikasi diperoleh dengan menggunakan b-galaktosidase dan alkaline fosfatase dalam kaitannya dengan analisis stripping kronopotensiometri dari produk-produk enzimatisnya, fenol dan a-naftol pada elektrode kerja pensil grafit yang dapat dibarukan (pada 0,63 dan 0,31 V, berturut-turut). Limit deteksinya adalah 0,7 dan 0,9 ng/mL atau 5,5 fmol dalam 50 µL sampel untuk dua target.
Bagel et al. (2000) mengajukan suatu sensor elektrokimia disposable untuk cytomegalovirus manusia berdasarkan penggunaan SPE yang dilapisi dengan nafion disesuaikan terhadap dasar mikrowell polistirena. DNA terdenaturasi yang diamplifikasi PCR diamobilisasi, diikuti dengan hibridisasi dalam larutan yang mengandung 50 ng/mL oligonukleotida probe yang terbiotinilasi. Setelah pembilasan dan konjugasi dengan streptavidin-alkaline fosfatase selama 15 menit, substrat dibiarkan bereaksi selama 30 menit dan deteksi dilakukan dengan CV. Penulis melaporkan limit deteksinya 10 amol/mL. Cabig-Ciminska et al. (2004) mengajukan suatu detektor listrik berdasarkan
chip silikon dipasangkan dengan hibridisasi pada magnetic bead untuk deteksi rRNA dalam ekstrak E. coli. Gold microelectrode array terdiri dari empat pasang elektrode interdigitasi plus dua elektrode pembantu. Tahap-tahap preparasi biosensor tersebut: a) Amobilisasi probe terbiotinilasi; b) Hibridisasi dengan target; c) Hibridisasi bertingkat dengan oligonukleotida berlabel digoksigenin; d) Inkubasi dengan suatu konjugat antidigoksigenin-alkaline fosfatase; e) Penambahan p-aminofenol fosfat; f) Deteksi amperometri untuk menurunkan p-aminofenol setelah pentransferan pada chip.
Pengukuran dilakukan dengan set potensial dari satu jari pada 250 mV sementara yang lainnya -50 mV. Dalam hal ini suatu resiklus terjadi antara p-aminofenol dan quinoneimine (produk reduksinya) mengamplifikasi respons amperometri. Perbedaan antara respons anodik dan katodik adalah penggunaannya sebagai signal. Dengan pengujian ini adalah memungkinkan untuk mendeteksi 1011– 1010 molekul target. Suatu biosensing listrik ultrasensitif DNA diajukan dengan menggunakan CNT untuk pengenalan dan untuk terjadinya transduksi (Wang et al. 2004). Alkaline fosfatase diamobilisasi pada CNT menggunakan linker karbodiimida. Hampir 104 kali peningkatan sensitivitas diperoleh dalam keberadaan CNT yang dimodifikasi dengan alkaline fosfatase. Bagaimanapun, jika menggunakan GC dimodifikasi dengan nanotube karbon sebagai transduser, amplifikasi kedua diperoleh (30 kali lipat), dalam kaitannya dengan penambahan akumulasi produk enzimatis a-naftol dengan keberadaan CNT. Limit deteksi yang rendah diperoleh selama akumulasi 20 menit, sekitar 1 fg/mL, atau 54 aM, atau 820 copy, atau 1.3 zmol dalam 25 µL sampel.
2.5.5. Berdasarkan Metodologi Lain
Palecek et al. (2002e) mempresentasikan untuk pertama kalinya penggunaan immunogenisitas dari DNA termodifikasi untuk pengembangan biosensor hibridisasi DNA. Respons immunologi DNA dan RNA dapat ditingkatkan dengan modifikasi kimia menggunakan Os,bpy. Magnetic bead yang mengandung oligo(dT)25 diletakkan dan dihubungkan dengan Os,bpy-DNA untuk dikenali antibodi primer yang mengandung residu 25-adenin diikuti dengan interaksi dengan antibodi sekunder yang dilabel alkaline fosfatase. Dalam hal ini, setelah penambahan 1-naftilfosfat, produknya, a-naftol dapat ditentukan secara elektrokimia. Pengukuran langsung DNA target yang dimodifikasi secara kimia secara adsorptive stripping SWV pada pyrolitic graphite yang di-pretreatment pada -1,7 V selama 60 detik dalam elektrolit (bufer asetat 0,2 M, pH 5,0) juga dilaporkan. DNA dilepaskan dari magnetic bead dengan pemanasan pada temperatur 85oC selama 2 menit, diikuti dengan penambahan NaCl hingga 0,2M. Penulis juga menunjukkan adanya kemungkinan untuk menentukan DNA-Os,bpy tanpa pemisahan sebelumnya produk tambahan dari campuran reaksi. Metodologi juga diuji dengan produk PCR 226 pb DNA dengan residu (dA)25. Setelah presipitasi etanol dan modifikasi Os,bpy, dihibridisasi dalam konsentrasi 5 dan 2,5 µg/mL. Limit deteksi dalam tahap hibridisasi dihitung adalah 3 fmol menggunakan sel 1mL. Jika menggunakan dua sistem elektrode dan 20 µL, dalam 1 pg target akan terdapat 30 amol.
Evtugyn et al. (2003) mengajukan penggunaan elektrode graphite screen-printed dimodifikasi dengan DNA dan enzim untuk deteksi antibodi DNA manusia dari lupus erythematosus sistemik dan bronchial asthma. SPE di-treatment secara elektrokimia dan kemudian dilapisi dengan larutan stok DNA dan peroksidase atau kolinsterase yang mengandung 0,01% gelatin, diikuti dengan penambahan 5 µL glutaraldehid, dan tahap pengeringan selama 15 menit pada temperatur ruang. Signal analitik merupakan arus yang diukur pada 680 mV atau -150 mV setelah penambahan S-asetiltiokolin atau hidroquinon, berturut-turut. Pada saat menguji sampel sebenarnya, 20 µL serum darah disebarkan pada daerah kerja, setelah inkubasi, pengukuran amperometri dilakukan, dan diperoleh penurunan signal menunjukkan pembentukkan tambahan antibodi DNA yang menurunkan aksesibilitas enzim dalam reaksi enzimatis dengan substrat.
Suatu protokol inovatif berdasarkan perubahan konformasi oligonukleotida probe telah diajukan akhir-akhir ini (Fan et al. 2003). Probe terdiri dari struktur DNA stem-loop dengan penanda elektroaktif ferrosin (28-mer), diamobilisasi secara self-assembling melalui residu tiol pada permukaan emas polikristalin. Satuan stem loop didisain memiliki lima basa komplementer pada ujung 5’ dan 3’ (empat dari mereka adalah pasangan G-C) sehingga stem-loop dengan kedua ujungnya sangat dekat pada permukaan emas dan menjaga ferrosin pada ujung 5’ dekat dengan permukaan emas. Perubahan besar konformasi dihasilkan setelah hibridisasi karena meningkatnya jarak antara ferrosin dan elektrode, menurunkan signal voltametri dari residu ferrosin (pada 0,492 V. Limit deteksinya adalah 10pM setelah inkubasi 30 menit. Cara lain deteksi listrik hibridisasi DNA adalah berdasarkan penggunaan runutan batang mikro indium yang diperoleh secara elektrodeposisi logam ke dalam pori membran alumina yang dilaporkan oleh Wang et al. (2003f). Batang indium/emas dibuat dengan elektroplating membran alumina (pori 200 nm) dengan perak untuk mendapatkan kontak listrik untuk elektrodeposisi selanjutnya. Setelah pelarutan membran dan penghilangan residu DNA yang diamobilisasi dengan penggabungan oligonukleotida bertiolasi terhadap dispersi 2 mL 0,1 mg batang mikro indium/emas selama 16 jam pada temperatur ruang. Deteksi dilakukan secara solid-state derivative chronopotentiometric dari batang indium mikrometer setelah pengumpulan magnetik pada SPE dilapisi merkuri yang sebelumnya dikondisikan selama 2 menit pada 1,8 V menggunakan magnet eksternal sebelum penempelan partikel/DNA. Hibrid yang terbentuk pada permukaan magnetic bead modifikasi streptavidin yang mengandung probe terbiotinilasi, diikuti dengan interaksi dengan target dan dengan oligonukleotida yang mengandung probe tambahan. Selanjutnya, pada saat terbentuk, penanda batang indium diukur 1 menit pra-kondisi pada -0,10 V.
Penentuan dilakukan pada 1 µA. Cara yang lain yang telah dilakukan adalah dengan
melarutkan konjugat partikel DNA-linked dalam asam nitrat 6M dan memindahkan larutan ini ke dalam bufer asetat 100 mL. Penentuan dilakukan pada elektrode carbon fiber dilapisi merkuri. Dengan pengujian ini memungkinkan amplifikasi respons 5625 kali, dan menurunkan limit deteksi. Limit deteksi diperoleh sekitar 4 ng/L, atau 210 fM, atau 100 fg, atau 10 amol dalam 50 µL larutan.
Penutup
Di Indonesia penelitian di bidang biosensor telah berkembang pesat. Tetapi kebanyakan penelitian di bidang ini berhenti pada tahap publikasi ilmiah di jurnal-jurnal atau seminar-seminar. Dan tidak sampai menyentuh tahap paten/aplikasi untuk di komersialisasikan. Hal ini sangat di sayangkan, padahal penelitian para ilmuwan Indonesia sangat aplikatif semisal tentang penelitian pembuatan biosensor untuk mendeteksi kadar alkohol atau daging hewan tertentu pada produk makanan atau minuman, atau penelitian untuk membuat biosensor yang mampu mendeteksi pestisida, serta berbagai penelitian lainnya. Semuanya ini berpotensi untuk dikembangkan.
Secara kualitatif, kebutuhan akan biosensor di Indonesia sangat besar. Dan diperkirakan permintaan biosensor di pasaran dunia akan selalu meningkat tiap tahun. Sebagai perbandingan, data statistik menunjukkan untuk penjualan sensor di bidang non milter saja pada tahun 2008 akan mencapai 50-51 miliar dolar AS. Hal ini dari sisi ekonomis sangat mengiurkan. Sehingga sudah seyogyanya para peneliti dan pemerintah Indonesia memanfaatkan momentum tersebut untuk dapat merintis dan mengembangkan sistem sensor dengan kreatifitas, langkah dan kebijakan yang lebih baik lagi.
Daftar Pustaka
Day, R. A., Underwood. A.L., (1999), Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Kelima, Penerbit Erlangga, Jakarta
Pudjaatmaka,A.H., Setiono, L., Vogel, (1994), Kimia Analisis Kuantitatif AnOrganik Edisi Empat, Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta.
Situmorang, M. (2010) Kimia Analitik Lanjut dan Instrumentasi. Penerbit FMIPA, Unimed; Medan.
